Emilie Dequenne prend dès l'âge de huit ans des cours de comédie. Le bac en poche, alors qu'elle suit des cours de sciences politiques, elle répond à une annonce de casting des frères Luc et Jean-Pierre Dardenne, qui en font leur Rosetta parmi 2 000 candidates. Son rôle de jeune fille fragile et forte à la fois, confrontée à la rudesse du monde actif, lui vaut un prix d'interprétation à Cannes en 1999, ex-aequo avec Severine Caneele pour L' Humanite.Après ces débuts tonitruants devant la caméra, Emilie Dequenne change totalement de registre en jouant dans Le Pacte des loups, film d'aventures réalisé par Christophe Gans. La jeune femme se spécialise ensuite dans la comédie, s'illustrant consécutivement dans Oui, mais, Une Femme de ménage, Mariées mais pas trop ou L' Américain. Sa carrière prend un nouvel essor en 2004, elle joue dans la comédie dramatique L' Equipier aux côtés de Sandrine Bonnaire et Philippe Torreton. Après quoi, elle retrouve Samuel Le Bihan au sein de la distribution internationale du Pont du roi Saint-Louis. Une fresque historique où elle donne la réplique à Gabriel Byrne, Robert De Niro et Harvey Keitel.
Passant avec aisance du classicisme du Grand Meaulnes (2006) à la fantaisie des Etats-Unis d'Albert (id.), Emilie Dequenne s'essaie en 2007 au thriller avec Ecoute le temps et goûte, aux côtés de Sandrine Kiberlain et Denis Podalydès, à La Vie d'artiste de Marc Fitoussi. On la retrouve également chez André Téchiné pour qui elle joue en 2009 La Fille du RER, l'histoire d'un mensonge devenu l'un des faits divers les plus médiatisés. Elle partage la même année l'affiche avec Omar Sharif du premier film de Laurent Vinas-Raymond, drame identitaire d'amour et de peinture, puis elle rejoint le casting de l'étrange survival à la française, La Meute, inscrivant ainsi un genre nouveau à sa palette de comédienne.
En 2012, Emilie Dequenne livre une performance bouleversante en mère de famille désespérée qui commet l'irréparable dans A perdre la raison aux côtés de Tahar Rahim et Niels Arestrup. Elle poursuit avec deux thrillers qui ne trouvent pas leur public (La Traversée et Möbius) puis revient à un registre plus léger avec Pas son genre de Lucas Belvaux et Maman a tort de Marc Fitoussi. L'engagé Belvaux fait en 2016 à nouveau appel à la comédienne pour camper le personnage principal du polémique Chez nous qui se centre sur le fonctionnement de l'extrême droite française et son inquiétant pouvoir de séduction chez les gens.
