Originaire de Belgique, Jonathan Zaccai pense d'abord à une carrière de réalisateur avant de se tourner vers le métier d'acteur. Après un passage par la publicité -il figure dans de nombreux spots diffusés pour certains en Angleterre- et quelques apparitions au cinéma (La Révolte des enfants, 1991) et à la télévision (Lifeline, 1996), il campe le petit ami insatisfait de Corinne Debonnière dans Petite chérie (2000) d'Anne Villaceque. Sa carrière lancée, il balade son physique de jeune premier dans Les Declassés (2001) et Reines d'un jour (id.). Aimant jouer dans des premiers longs métrages, il incarne le compagnon maladroit d'Hélène Fillières dans Bord de mer (2002) de Julie Lopes-Curval, et danse Le Tango des Rashevski (2003) pour Sam Garbarski.Le grand public le découvre véritablement aux côtés d'Agnès Jaoui et Karin Viard dans Le Rôle de sa vie (2004), tandis que la critique salue sa prestation de mort-vivant au regard pénétrant dans Les Revenants (id.) de Robin Campillo. Valeur montante du cinéma français, il partage en 2005 avec Hélène De Fougerolles la tête d'affiche du Plus beau jour de ma vie, une comédie populaire sur le mariage. Dans un registre plus noir, il incarne un agent immobilier escroc aux côtés de Romain Duris pour les besoins de De battre mon coeur s'est arrêté de Jacques Audiard.
