Etudiant à la Guildhall School of Music de Londres, Alfred Molina fait ses premiers pas sur les planches de la capitale anglaise, avant d'être remarqué en 1981 dans Les Aventuriers de l'Arche perdue. Ses origines espagnoles (par sa mère) et italiennes (par son père) lui permettent dès lors souvent d'endosser des rôles typés : après Ladyhawke, la femme de la nuit (1985) de Richard Donner, l'acteur incarne le terrifiant père de famille iranien de Jamais sans ma fille en 1991. Cantonné aux seconds rôles, Alfred Molina retrouve Richard Donner dans Maverick en 1994, puis apparaît dans Dead Man de Jim Jarmusch (1995) et La Mutante de Roger Donaldson en 1995. Deux ans plus tard, le comédien rencontre Paul Thomas Anderson qui lui offre un rôle de dealer dans son premier long métrage, Boogie Nights, avant de l'enrôler dans Magnolia. Comte de Reynaud dans Le Chocolat de Lasse Hallström en 2000, Alfred Molina incarne Diego Rivera, le mari de Frida Kahlo dans Frida de Julie Taymor. En 2002, il enchaîne avec les tournages de Identity et celui de Coffee and cigarettes, de Jim Jarmusch. En 2003, Il fait sa première incursion dans l'univers des Comics, en incarnant à l'écran le terrifiant Dr Octavius dans la suite des aventures de l'homme-araignée, Spider-Man 2.
