Après des études littéraires à la prestigieuse université de Harvard, Matt Damon choisit de monter sur les planches, et connaît son premier succès avec la pièce The Speed of Darkness de Steve Tesich. Il fait ensuite des débuts remarqués au cinéma en 1988 dans la comédie dramatique Mystic Pizza de Donald Petrie aux côtés de Julia Roberts, star montante à l'époque, et de Lili Taylor. Le jeune acteur décroche ensuite plusieurs seconds rôles, notamment dans le Geronimo de Walter Hill en 1993, puis donne la réplique en 1996 à Meg Ryan et Denzel Washington dans A l'épreuve du feu de Edward Zwick. Désormais considéré comme une valeur montante à Hollywood, il campe L'Idealiste de Francis Ford Coppola en 1997. La même année, il écrit avec son ami Ben Affleck le scénario de Will Hunting. Ce film, réalisé par Gus Van Sant, où il tient également le rôle principal, est salué par la critique et le public et obtient l'Oscar du Meilleur scénario ainsi que l'Ours d'argent à Berlin.
Star montante, Matt Damon tourne Il faut sauver le soldat Ryan (1998) sous la direction d'un autre réalisateur de renom, Steven Spielberg, puis interprète le rôle-titre du Talentueux M. Ripley (1999) aux côtés de Jude Law et de Gwyneth Paltrow. Cultivant un certain goût pour l'autodérision, Matt Damon n'hésite pas à s'illustrer chez les doux dingues Kevin Smith et frères Farrelly pour qui il interprète respectivement les comédies Dogma (1999) et Deux en un (2004). En 2001, Ocean's Eleven (2001) marque son entrée dans le clan Soderbergh. La collaboration entre ces deux hommes se poursuivra avec Ocean's 12 (2004), Ocean's 13 (2007) et The Informant ! (2009), rôle pour lequel Matt Damon apparaît moustachu et grossi de 13 kilos. Parallèlement, il prête ses traits au héros de Robert Ludlum Jason Bourne, dans une trilogie qui réinvente les codes du cinéma d'action : La Mémoire dans la peau (2002), La Mort dans la peau (2004) et La Vengeance dans la peau (2007).
Fort de cette popularité grandissante, Matt Damon aime à travailler sur des projets ambitieux comme le film choral Syriana et à s'entourer de cinéastes de renom comme Terry Gilliam (Les Frères Grimm, 2005), Martin Scorsese (Les Infiltrés, 2006), Robert De Niro (Raisons d'Etat, 2007) ou Clint Eastwood (Invictus, en 2010, pour lequel il est nominé aux Oscars).
En 2010, il retrouve le réalisateur Paul Greengrass (avec qui il avait déjà travaillé sur les deux derniers volets de la trilogie Jason Bourne) pour le thriller Green Zone sur fond de guerre en Irak. Sa collaboration avec le réalisateur britannique n'en finit pas d'être fructueuse puisqu'il rempile en 2011 pour le quatrième épisode de la saga d'espionnage qui en a fait une star planétaire avec Jason Bourne 4.
L'acteur retourne jouer pour la quatrième fois pour Gus Van Sant en 2012 dans son film Promised Land, qu'il co-écrit et produit, avant d'obtenir le rôle principal d'Elysium, du jeune réalisateur Neill Blomkamp, où il partage la vedette avec Jodie Foster. Diversifiant encore et toujours ses interprétations, il incarne l'amant de Michael Douglas dans Ma vie avec Liberace, qui lui vaut une nomination comme meilleur acteur dans un second rôle aux Golden Globes et aux British Academy Film Award. Il retrouve George Clooney dans le film de ce dernier, Monuments Men, qui lui permet de côtoyer pour la première fois Bill Murray et Jean Dujardin.
