Voué à l'enseignement, Brendan Gleeson est instituteur jusqu'à ses trente ans, âge où sa passion pour la comédie le rattrape. Se produisant pour la première fois sur scène en 1987 à Dublin, ce résident irlandais apparaît ensuite au cinéma sous la direction de Jim Sheridan dans The Field (1990). Après de multiples prestations télévisées, il est révélé au grand public en devenant Hamish, le compagnon d'armes de Mel Gibson dans Braveheart (1995), puis en s'illustrant dans une autre fresque révolutionnaire, Michael Collins (1996) de Neil Jordan.Frappé par leur ressemblance physique, John Boorman fait appel à Brendan Gleeson pour lui confier le rôle du légendaire gangster irlandais Martin Cahill dans Le Général (1998). Cette prestation très remarquée lui vaut d'être distingué à trois reprises, recevant successivement le Boston Film Critics Award, le London Film Critics Award et l'Irish Film and Television Association Award. Son physique imposant lui permet par ailleurs d'alterner les personnages tantôt autoritaires (shérif dans Lake placid), sympathiques (A.I. Intelligence artificielle, 28 days later) ou rustres (Le Tailleur de Panama, Gangs of New York).Habitué aux grandes fresques épiques, Brendan Gleeson prête également ses traits au personnage mythologique Ménélas dans Troie (2004), récit de l'Iliade revisité par Wolfgang Petersen, puis peuple la même année Le Village de M. Night Shyamalan. Après cette grande production, il rejoint ses terres natales, pour participer à un court-métrage et à un petit film. Puis, Ridley Scott l'engage pour interpréter un roi fourbe, chevalier de l'ordre des Templiers dans Kingdom of Heaven, où il retrouve son compatriote Liam Neeson.
Toujours en 2005, il rejoint l'univers magique de Poudlard et se glisse dans la robe de Maugrey Fol-Oeil, nouveau Professeur de Défense contre les forces du Mal dans Harry Potter et la Coupe de Feu de Mike Newell, avec qui il avait déjà travaillé. Il continue d'incarner son personnage jusqu'à la fin de la saga, en 2011. A titre anecdotique, l'un des quatre fils de Gleeson, Domhnall Gleeson, apparaît sous les traits de Bill Weasley dans Harry Potter et les reliques de la mort.
Depuis quelques années, l'acteur s'illustre aussi dans des comédies britanniques toujours très marquées par un certain folklore : ainsi, il donne la réplique à Colin Farrell, irlandais lui aussi, dans Bons Baisers de Bruges en 2008, et s'amuse des clichés qui collent à la peau de son peuple dans un film qui porte bien son nom : L'Irlandais (2011) ! Ne délaissant pas les productions américaines pour autant, il incarne Martin Brown dans Green Zone en 2010, donnant ainsi la réplique à Matt Damon.
Deux ans plus tard, il regagne l'Irlande dans Albert Nobbs, où il joue le Dr. Holloran aux côtés de Glenn Close. Toujours en 2012, Brendan Gleeson migre à nouveau vers les États-Unis, en interprétant le colonel Hamilton dans le biopic revisité d'Egdar Allan Poe, L'Ombre du Mal, aux côtés de l'Américain John Cusack, et est également à l'affiche du thriller d'action Sécurité rapprochée, une sorte de mélange entre La Mémoire dans la peau et Training Day, avec Denzel Washington. Le comédien élargit également ses horizons en s'essayant au doublage pour le film d'animation : Les Pirates ! Bons à rien, Mauvais en tout ; expérience qu'il réitère avec Les Schtroumpfs 2 et Le chant de la mer.
Toujours abonné aux films d'action américains, Brendan Gleeson joue dans Edge of Tomorrow aux côtés de Tom Cruise et Emily Blunt, plonge Au Coeur de l'océan pour Ron Howard et partage l'affiche d'Assassin's Creed avec Michael Fassbender, Marion Cotillard et Jeremy Irons. Il n'en délaisse pas pour autant les productions britanniques : il livre une performance remarquable en prêtre menacé de mort dans Calvary, assume le mauvais rôle face aux Suffragettes Carey Mulligan, Helena Bonham Carter et Meryl Streep, et se retrouve Seul dans Berlin dans le nouveau film de Vincent Perez.
Il retrouve Fassbender dans le drame sur une famille de hors-la-loi A ceux qui nous ont offensés, donne la réplique à Isabelle Huppert dans Frankie et campe le roi Duncan dans The Tragedy of Macbeth.
le natif de Dublin refait équipe en 2022 Martin McDonagh et Colin Farrell pour le drame Les Banshees d'Inisherin. Il sera également à l'affiche de la tant attendue suite de Joker avec Joaquin Phoenix.
